STR位点基因扫描在亲子鉴定中的应用

作者：中正鉴定 发布时间：2017-04-08 22:18:37 人气：33

亲子鉴定是一个古老的问题,但从鉴定的技术发展看,又是一个新的课题。几个世纪以来,证实某男性是孩子的生父一直是一个困难的问题。直到1985年DNA指纹技术建立,才使得亲子鉴定由否定走向肯定1。随着新的遗传标记如STR等不断发现,亲子鉴定的方法也不断发展。国内各实验室进行亲子鉴定方法不尽相同。国内亲子鉴定的现状是:①遗传标记的选择不统一,不利于标准化,不利于比较和交流;②由于方法不规范等造成等位基因丢失等原因,使结果出现偏差;③遗传标记的检测方法没有统一的质量控制标准,所以寻找一种易于标准化的亲子鉴定方法成为法医界的共识。1　材料

1.1　样本　亲子鉴定案例45例,共134人。日常亲

1.2　主要仪器　DNA自动测序仪(377A);DNA扩

增仪(PE9700)等。

1.3　主要试剂　PCR引物(5‘2末端荧光素标记);4种dNTP等。2　方法

2.1　DNA提取　微量快速盐析法。2.2　DNA定量　琼脂糖凝胶电泳。

2.3　PCR复合扩增　其中模板量0.8μL,ddWater2.4μL,STRbuffer3.04μL,STRPrimer1.6μL,

μTaqDNAPolymerase(5U・L,总体积为L-1)0.16μ8μL。

2.4　电泳　电压3000V,电流40mA,功率120W,

温度控制在51℃,电泳时间为2h30min。2.5　基因扫描　377测序仪在电泳开始时,激光检

子鉴定案件收集的样本,均为汉族群体。

测仪就开始工作,收集电泳分离的全部电泳图谱信息,自动存于计算机中。电泳图谱中不同位点的等位基因显示出不同颜色,同一位点的不同等位基因显示

同一颜色。

2.6　基因分型　应用Genotyper分析软件,把基因扫描形成数据信息,与设计的一定片段大小的内标(ROX2350)比较,从而判定等位基因的片段大小并命名。

2.7　数据处理　计算父权指数(paternityindex,PI);父权相对几率(relativechanceofpaternity,RCP);非父权相对几率(relativechanceofnon2pater2nity,RCNP)3　结　　果

3.1　在45例亲子鉴定案例中,有21例可疑父亲被排

除与孩子有亲子关系,而有24例可疑父亲不排除与孩子有亲子关系。这与既往的方法所做结果完全一致。

在21例排除亲子鉴定案例中,1例在9个STR位点中有7个位点不符合遗传规律;有1例为FGA1个位点被排除,FGA位点被排除的次数最多,为15次,CSF1PO位点和D13S317位点为14次,这是因为FGA位点的DP为0.9395、H为0.8371,都比较高。故在亲子鉴定中应选用DP、H值都比较高的位点。3.2　根据父权否定原则,有24例可疑父亲不排除与孩子有亲子关系。经过计算,24例的RCP均大于99.73,最小的为99.81,最大的为99.99994,均能肯定24例的可疑父亲是孩子的生物学父亲。24例不排除

亲子关系案例的9个STR位点检测结果见表1。3.3　自动分析软件和内标直接判断出样本的基因型,结果略。4　讨　　论

4.1　短串联重复序列(shorttandemrepeats,STR)　短串联重复序列(STR)是一类广泛存在于真核生物

基因组中的DNA串联重复序列。它由2～6bp的核

心序列构成,重复次数通常在15～30次,DNA片段长度为100～350bp,由于STR很容易通过PCR扩增2、电泳分型,所以是目前常用的遗传标记,特别是应用于法医学领域有诸多优点:①STR在人类基因组中广泛分布,等位基因多,杂合度高。②STR扩增片段短,一般在100～350bp之间,扩增率高,灵敏度比传统的DNA指纹高得多。③各个STR位点扩增片段长度近似,扩增条件相似,可进行复合扩增。④STR核心序列重复单位少(2～6bp),Amp2FLP时不会造成小片段优先扩增的错误,其稳定性是RFLP和VNTR不能比拟的。⑤检测方法简单省时,且易实现自动化、标准化。

表1　不排除案例的计算结果

Table1　Calculatedresultsofnon2excludedcasesNumberCasenumber　CPI

RCP　RCNP112149.12　99.95　0.052230077.4999.990.01332414.03899.960.04449304.5299.980.0256(F3)20367.34

99.990.0167463.0199.870.1379(C1)572.0199.820.1889(C2)1978.7599.950.059101171.9399.910.091012(F1)539.5199.810.1911139148.2199.980.0212171263.8399.920.081319890891.4499.999940.00006142024892.0199.990.01152741467.3999.990.011628235164.3799.990.01175219737.9999.990.011854774.7799.870.131956709.0799.840.1420602949.4499.960.0421622952.2399.960.0422631660.0399.940.062364(C1)3804.2199.970.0324

64(C2)

4332.54

99.97

0.03

Notes:F:Father;C:Children;CPI:CombinedPaternityIndex

CPI=PI1×PI2×……PIn;RCP=CPI/CPI+1RCNP=100%-RCP

4.2　遗传标记的选择　STR位点的选择:由于二核

苷酸重复的STR位点在复制时存在线性滑动,导致

基因型和等位基因模糊判读。若重复片段过长,则PCR扩增效率低。故STR位点选择是:三核苷酸和四核苷酸重复。在STR复合扩增时,应选用同是三核苷酸或四核苷酸重复的位点。选用染色体定位清楚,与其他STR遗传标记无连锁,突变率足够低,群体等位基因频率已阐明,基因型在群体中的分布处于Hardy2Weinberg平衡,个体识别机率和非父排除概率足够高的STR位点3。4.3　STR位点的检测　1977年,Sanger4等建立了经典的双脱氧链末端终止法。进入90年代以后,DNA序列分析的双脱氧链末端终止法有两方面大的改进:标记物和电泳方法。

用PE公司的ABI377测序仪,超薄聚丙烯酰胺电泳分离DNA,结果用计算机处理,软件主要有GeneScan分析软件和Genotyper软件。在进行PCR复合扩增时,用四种颜色的荧光染料(FAM、JOE、

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NED、ROX)分别标记引物和等位基因标记物。电泳

分析结果经激光扫描激发多色荧光,这些信息经过计算机处理后,自动判别等位基因及变异型。4.4　亲子鉴定STR基因扫描方法与既往方法比较

　在既往的方法中,亲子鉴定需采用多种遗传标记和多种实验方法,样本用量大,时间长,结果用肉眼或显微镜进行判读。CPI低于370时,需做更多的遗传标记。多种遗传标记的显隐性、有无连锁等在计算CPI、RCP时方法不同5。

1989,44:388-389.

[3SangerF.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA

J.

1997,74:5463-5467.

Evaluationofanalkalinelysis

[4KlintscharM,NenhuberF.

methodfortheextractionofDNAfromwholebloodandforensicstainsforSTRanalysisJ.JForensicSci,

本文选用9个STR位点,用STR基因扫描,直接检测的是基因型。用GeneScan分析软件和Genotyper软件由计算机自动判读。在本文的案例中,CPI大于539.51。STR基因均为共显性,CPI和RCP的计算简便。DNA用量少,实验在24h内完成。

径与妄想症状呈高度显著负相关,左颞上回面积与妄

想症状呈显著负相关关系。因为病例组与对照组之间左颞高径和左颞上回面积无明显差异,未能重复Barta等所做的研究结果。在此种情况下,似乎这种负相关关系缺乏实际意义,但先前的研究已提示颞上回缺陷与听幻觉和思维障碍相关联5。也许,出现不一致结果的可能原因在于本研究对于颞叶上、中、下回面积测量限定于可区分沟回边界范围内的面积,对颞叶近中线部分颞上、中、下回联结的灰质部分未做测量之故,因而不能就此否定精神分裂症左侧颞叶发育存在缺陷。况且,最大垂体轴冠状面颞叶结构扫描图还远离颞平面,因而本研究的颞叶上、中、下回面积并未涉及颞平面。假如应用更高分辨率MRI机型,同时测量颞叶灰白质体积,也可能会重复出Bar2ta,Anderson等(2002)和Sumich等(2002)的结果。很重要的是本研究结果提示精神分裂症病人存在高比率的右颞下回发育缺陷。

就精神分裂症脑结构缺陷与精神症状单元的相关研究而言,结果存在着相当的不一致。据现有的资料,精神病理性症状主要与前额叶、颞叶、海马结构、左侧岛叶及扣带回等脑结构的缺陷有关11-13。随着脑结构形态测量技术的不断完善和更高分辨率MRI机型的出现,终将获得对精神分裂症脑形态学普遍认同的研究结果。

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